Forschung am NRL zur Überwachung von marinen Biotoxinen

Forschungsfelder

Bei der Forschung des NRL zur Überwachung von marinen Biotoxinen stehen die Entwicklung und Validierung robuster und empfindlicher chemisch-analytischer Analysenmethoden sowie funktionaler Assays im Vordergrund.

Folgende Projekte sind am NRL für Marine Biotoxine in Bearbeitung:

• Entwicklung und Validierung von chemisch-analytischen Multitoxin-Methoden zur Erfassung
  • der PSP-Toxine
  • von Tetrodotoxinen (TTX) mittels LC-MS/MS
  • von Ciguatoxinen (CTX) mittels LC-MS/MS
  • von Cyanotoxinen mittels LC-MS/MS
• Entwicklung und Validierung eines zellbasierten Screening-Verfahrens für den Nachweis von CTX und anderen Ionenkanal-aktiven Toxinen (Neuro2a-Assay)

PSP-Toxine

Saxitoxin und seine verwandten Verbindungen zählen zu den paralytisch wirksamen Toxinen. Sie werden von einzelligen Planktonorganismen wie Dinoflagellaten der Gattung Alexandrium im Meerwasser oder von Cyanobakterien im Süßwasser gebildet. Die Toxine können sich u.a. in Muscheln und Meeresfrüchten anreichern. Eine wichtige Rolle im vorbeugenden Verbraucherschutz spielt neben der Kontrolle der Muscheln die Überwachung der Muschelfanggewässer hinsichtlich des Auftretens von PSP-Toxin produzierender Organismen. Letzteres ist Aufgabe der amtlichen Überwachungsbehörden der Bundesländer, in denen Muschelfanggebiete vorhanden sind.

Muscheln werden vor dem Vertrieb auf den Gehalt an PSP-Toxinen untersucht. In der EU ist gegenwärtig eine HPLC-Methode mit Vorsäulen-Derivatisierung und Fluoreszenzdetektion (sogenannte Lawrence-Methode, DIN EN 14526) als analytische Referenzmethode anzuwenden. Diese zeitaufwändige und arbeitsintensive Methode ist von sehr gut geschultem, wissenschaftlich-technischem Personal durchzuführen. Ein weiterer Nachteil dieser Methode ist, dass einige PSP-Toxine chromatographisch nicht getrennt werden, wodurch das toxische Potenzial einer Probe überschätzt werden kann.

Das NRL arbeitet an der Optimierung und Verifizierung bzw. Validierung von Alternativmethoden. Diese umfassen eine HPLC-Methode mit Nachsäulen-Derivatisierung und Fluoreszenzdetektion, sowie eine LC-MS/MS-Methode. Das NRL bietet Schulungen für die amtlichen Laboratorien zu der Durchführung der Methoden mittels Vor- und Nachsäulen-Derivatisierung an.

Tetrodotoxine (TTX)

Marine Biotoxine können sich nicht nur in Muscheln, sondern auch in Fischen anreichern. Ein Beispiel ist die Anreicherung von Tetrodotoxinen (TTX) in einigen Kugelfisch-Spezies. TTX standen bisher ausschließlich mit Vergiftungen (u.a. Lähmungen) nach Verzehr von Kugelfischen (Tetraodontidae) im Zusammenhang. Seit einigen Jahren werden vereinzelt und in niedrigen Konzentrationen TTX in Muscheln, Austern und Schnecken aus europäischen Fanggewässern nachgewiesen. Bislang gab es keine Berichte über Vergiftungserscheinungen nach dem Verzehr von in Europa gefangenen Meerestieren.

TTX können Lähmungen auslösen, die in seltenen Fällen tödliche Folgen haben können (z.B. Tod durch Atemlähmung). Eine gesundheitliche Bewertung des Vorkommens von TTX in Muschel- und Schneckentieren durch die Europäische Behörde für Lebensmittelsicherheit (EFSA) erfolgte 2017. Aufgrund der nicht ausreichenden Datenlage wurde kein Grenzwert für TTX empfohlen. Basierend auf den vorliegenden Daten wird angenommen, dass ein TTX-Gehalt von 44 µg pro kg Muschelfleisch keine negativen gesundheitlichen Effekte hervorruft (angenommene Verzehrmenge von 400 g bei einer 70 kg schweren Person).

Eine Referenzmethode für die Bestimmung von TTX in Muscheln steht zurzeit nicht zur Verfügung. Gemeinsam mit dem EU-weiten Netzwerk der Referenzlabore für die Kontrolle der Marinen Biotoxine und mit den amtlichen Laboratorien auf nationaler Ebene erarbeitet das BfR Bestimmungsmethoden für die Kontrolle der Tetrodotoxin-Gehalte in Muscheln. Ziel ist die Etablierung und Validierung einer LC-MS/MS-Methode.

Ciguatoxine (CTX)

Ciguatoxine sind marine Biotoxine, die von Algen in tropischen Gewässern gebildet und über das marine Nahrungsnetz in Raubfischen angereichert werden können. Die Vergiftung nach dem Verzehr Ciguatoxin-haltiger Fische wird Ciguatera genannt. Die Symptome dieser Vergiftung betreffen vor allem das Nervensystem. So kann es u.a. zu einer Umkehr des Warm-Kalt-Empfindens kommen.

In Deutschland trat Ciguatera bisher äußerst selten als reiseassoziierte Krankheit bei Personen auf, die in tropischen und subtropischen Ländern Fischgerichte verzehrt hatten und nach ihrer Rückkehr nach Deutschland Symptome zeigten. Seit 2012 traten hierzulande jedoch Ausbrüche auf, die auf den Verzehr von importiertem tropischen Fisch zurückzuführen waren. Gemäß Durchführungsverordnung (EU) 2019/627 dürfen Fischereierzeugnisse, die CTX enthalten, in der EU nicht in Verkehr gebracht werden.

Der Nachweis von CTX stellt sehr hohe Anforderungen an die Leistungsfähigkeit der Analysenmethoden, da diese Toxine bereits in äußerst niedrigen Konzentrationen Effekte verursachen. Sie weisen verschiedene chemische Strukturen auf, die je nach territorialem Fanggebiet variieren können. Aufgrund des Mangels an Standard¬substanzen ist die verlässliche und qualitätsgesicherte Bestimmung der CTX-Konzentration nur eingeschränkt möglich.

Bislang existiert keine validierte Analysemethode zur Untersuchung von CTX in Fischen. Das BfR arbeitet an der Entwicklung und Validierung einer Screeningmethode auf Basis eines funktionalen Assays für den qualitativen Nachweis von CTX (Neuro2a-Assay). Anhand dieses Assays ist auch der Nachweis anderer neurotoxischer Substanzen wie PSP- und TTX-Toxine möglich. Ein anderer Forschungsschwerpunkt ist die Entwicklung und Etablierung einer LC-MS/MS-Methode für die CTX-Analytik.

Cyanotoxine

Cyanotoxine wie zum Beispiel Microcystine, Cylindrospermopsin, Anatoxine oder Beta-methylamino-L-alanin werden von Cyanobakterien gebildet. Cyanobakterien, auch als Blaualgen oder Blaugrünalgen bezeichnet, kommen in Süßwasser vor. Die Toxine können somit in Süßwasserfischen oder in den entsprechenden Gewässern auftreten. Das massenhafte Auftreten von Cyanobakterien kann unter anderem zur Sperrung von Badeseen führen.

Im Handel sind verschiedene Nahrungsergänzungsmittel (NEM) auf Algenbasis erhältlich. Sind diese mit Cyanotoxinen belastet, kann eine Aufnahme von diesen Toxinen erfolgen. Aufgrund des steigenden Angebotes derartiger Produkte besteht der Bedarf an einer Bestimmungsmethode für Cyanotoxine in derartigen NEM.

Die Toxine weisen zum Teil sehr unterschiedliche Polaritäten auf. Die Extraktion und Bestimmung aller bekannten Cyanotoxine mit einer einzigen Multimethode sind nicht möglich. Bislang gibt es nur eine validierte Methode für die Bestimmung von Cyanotoxinen in Wasser. Aus diesem Grund wurden am BfR zwei LC-MS/MS-Methoden für die Bestimmung von Cyanotoxinen in NEM eingeführt. Diese sollen in einem nächsten Schritt validiert werden.